【關(guān)鍵詞】  大孔樹脂 夏枯草 齊墩果酸 熊果酸 分離純化

    夏枯草Prunella vulgarisL.是唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有降壓、**、抑制**、**和降血糖等作用［1］，其中兩種主要五環(huán)三萜類成分齊墩果酸和熊果酸已被證實具有**、**和抗病毒等作用［2，3］。硅膠柱層析是*常用的分離純化三萜類成分的技術(shù)，但其工藝流程較長，硅膠不易于再生，工業(yè)化成本高。近年來，大孔吸附樹脂技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢廣泛用于***中水溶性物質(zhì)的分離，如水溶性生物堿、黃酮類、苷類、皂苷類、多酚類或酸性化合物、糖類、維生素、色素等［4，5］。大孔吸附樹脂分離脂溶性成分，特別是三萜皂苷元的研究很少［6，7］。本文嘗試篩選大孔吸附樹脂對夏枯草中兩種五環(huán)三萜酸進行富集純化，以期對中藥夏枯草產(chǎn)品的開發(fā)和拓展齊墩果酸及熊果酸的藥源貢獻一點微薄之力。

　　1  器材與方法

　　1.1  儀器和試劑

　　夏枯草為市售藥材，經(jīng)鑒定為Prunella vulgaris L.的干燥果穗；齊墩果酸(Oleanolicacid,OA)和熊果酸(Ursolic acid,UA)對照品(HPLC純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所；D4020，S-8，X-5，AB-8，NKA-9，D3520，D4006，NKA-II型大孔吸附樹脂；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。
   PHS-3C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）；島津LC-2010A高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器VPSPD-M10A，Hedera ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5  μm)。

　　1.2  大孔吸附樹脂的預(yù)處理樹脂先用無水乙醇浸泡24h，待充分溶脹后用無水乙醇在提取器內(nèi)提取8h，以除去樹脂中所含雜質(zhì)。濕法裝柱至柱高2/3處，依次用下列溶液沖洗：95%(V/V)乙醇以流速2BV/h洗至流出液澄清；水以2BV/h的流速洗盡乙醇，φ(HCl)=5%的水溶液以流速4～6 BV/h進行淋洗，并浸泡2～4 h，水洗至中性；w(NaOH)=2%的水溶液以流速4～6 BV/h進行堿洗，水洗至中性，即處理完畢。

　　1.3  樣品制備及測定方法

　　1.3.1  夏枯草樣品制備 

　　將夏枯草在烘箱中60℃下干燥24 h，粉碎過40目篩。稱量大約2.0 kg粉末，加入10 L95%(V/V)乙醇80℃下回流兩次，2h/次，得深綠色浸膏。加適量水制成懸浮液后經(jīng)石油醚、氯仿、正丁醇萃取。將氯仿萃取部分濃縮蒸干，無水乙醇溶解后，用5%NaOH調(diào)節(jié)溶液pH=11，所得濾液用10%HCl酸化至pH=3，再加入1倍量pH=3的蒸餾水，過濾所得沉淀用蒸餾水洗至中性，60℃真空干燥，得到包含OA和UA在內(nèi)的三萜酸富集物，用pH=7的75%(V/V)乙醇溶液配制成兩者總量為2.137g/L的夏枯草樣品液。

　　1.3.2 夏枯草樣品中三萜酸含量測定 

　　采用反相高效液相色譜法測定OA和UA的含量，以保留時間定性，外標法定量。色譜條件如下：流動相為甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.3，V/V/V)；流速1.0ml/min；檢測波長λ=210 nm；進樣量10 μl；柱溫30℃。實驗發(fā)現(xiàn)OA和UA進樣量分別在0.36～3.6μg和0.78～7.8 μg時，進樣量(m/μg)和峰面積(s/μV·s)呈良好的線性關(guān)系。熊果酸的回歸方程式為s=187023+3.066 36×106 m,r=0.999 91；齊墩果酸的回歸方程式為s=7 341.52+2.563 81×106m，r=0.999 95。

　　1.4 大孔吸附樹脂篩選選擇D4020，S-8，X-5，AB-8等8種大孔吸附樹脂進行實驗，測定這8種樹脂對夏枯草中兩種五環(huán)三萜酸的靜態(tài)吸附量和解吸率以篩選樹脂。取1.0g預(yù)處理好的大孔吸附樹脂于帶塞的磨口錐形瓶中，加入OA和UA總濃度為2.137 g/L的夏枯草樣品液40.00ml，于室溫下振蕩（180 r/min）24 h至吸附平衡，測定濾液中兩者含量，按式(1)計算各樹脂的靜態(tài)吸附量。用pH=11的90%(V/V)乙醇溶液40.00ml對吸附飽和的樹脂進行解吸，測定解吸液中兩者的含量，按式(2)式計算解吸率。
   
　　吸附量（mg/g）-（Co-Ce）×Vm式(1)
   
　　解吸率（%）=V1c1(co-ce)V×100%式(2)
   
　　其中co起始濃度，ce平衡濃度，V吸附液體積琺樹脂質(zhì)量，c1為解吸液濃度，V1為解吸液體積。

　　1.5  靜態(tài)吸附實驗準確稱取已預(yù)處理的樹脂1.0 g于具塞的磨口錐形瓶中，加入OA和UA總濃度為2.137g/L的夏枯草樣品液40.00 ml，室溫下振蕩（180 r/min）24h至吸附平衡。定時取樣進行分析，計算吸附量，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。
   
　　準確稱取已預(yù)處理的樹脂1.0 g于具塞的磨口錐形瓶中，加入不同濃度的夏枯草樣品液40.00 ml，室溫下振蕩（180r/min）24h至吸附平衡，測定吸附平衡時夏枯草提取液中OA和UA的濃度，計算吸附量，繪制靜態(tài)吸附等溫線，并用Langmuir等溫吸附方程式對實驗結(jié)果進行擬合。

　　1.6  動態(tài)吸附容量的測定將夏枯草樣品液通過已預(yù)處理的裝有1.0g樹脂的層析柱，進行動態(tài)吸附，分段收集流出液，測定收集液中OA和UA的含量，考察泄露曲線，確定樣品液的*大上柱體積。

　　1.7  動態(tài)吸附和動態(tài)解吸實驗將10 g已預(yù)處理的樹脂濕法裝入2 cm×50cm層析柱中，將夏枯草樣品液以一定的流速通過色譜柱，測定流出液中OA和UA的含量，考察上柱液pH值、濃度、流速等因素對樹脂吸附性能的影響，確定*佳的吸附工藝條件。對已吸附樣品的樹脂用乙醇溶液進行動態(tài)解吸實驗，考察洗脫劑pH值、流速等對樹脂解吸性能的影響，測定不同條件下解吸液中OA和UA的濃度，確定*佳的解吸工藝條件。

2.1 樹脂篩選結(jié)果在相同的實驗條件下，測得各樹脂的靜態(tài)吸附解吸結(jié)果如表1所示，X-5型大孔樹脂對夏枯草中兩種三萜酸具有較高的吸附量和解吸率。實驗結(jié)果表明，吸附量較大的多為非極性或弱極性樹脂，如X-5、D4020、AB-8型等。原因可能是夏枯草中三萜類成分為皂苷元，屬于弱極性物質(zhì)，與這類大孔樹脂具有特異性吸附。而X-5型大孔樹脂較其它幾種非極性樹脂吸附、解吸能力更好，這可能跟其較大的比表面積和孔徑有關(guān)。表1 大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)性能參數(shù)及靜態(tài)吸附解吸結(jié)果
（略）

　　2.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)過程在充分時間內(nèi)用X-5型大孔樹脂吸附夏枯草樣品液至飽和，吸附時定時取樣測定OA和UA的濃度，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線（見如圖1）。結(jié)果表明8h后樹脂吸附平衡。

　　2.3 靜態(tài)吸附等溫線在室溫下，配制不同濃度的夏枯草樣品液，用X-5型大孔樹脂吸附飽和，測定吸附平衡時OA和UA的濃度，計算飽和吸附量，繪制靜態(tài)吸附等溫線見圖2。

　　采用Origin軟件的線性擬合工具，利用Langmuir等溫吸附方程的線性形式對實驗結(jié)果進行擬合，如圖3所示。Langmuir等溫吸附方程式是建立在試驗基礎(chǔ)上的吸附理論，其方程式如下：qe=qmKαCe/(1+KαCe)。其中Kα是Langmuir等溫吸附方程式常數(shù)，qm是吸附劑飽和吸附量，qe為平衡時的吸附量，Ce為平衡時的溶液濃度。以濃度Ce為自變量，Ce/qe為因變量，化Langmuir方程為線形方程Ce/qe=1/qmKα+Ce/qm。代入實驗數(shù)據(jù)得方程Ce/qe= 0.01485+0.025 04 Ce，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 70，擬合結(jié)果比較理想。

　　2.4   動態(tài)吸附容量的測定將OA和UA總濃度為1.324 g/L的夏枯草樣品液通過裝有1.0gX-5大孔樹脂的層析柱。每2 ml取1次吸附液，測定其中兩者的含量，繪制泄露曲線如圖4所示。我們發(fā)現(xiàn)上柱液體積為26ml時達到吸附飽和，這時樹脂的吸附量為21.93 mg/g。

　　2.5 上柱液的pH值對樹脂吸附量的影響取5份X-5樹脂10 g，濕法裝入2 cm×50cm色譜柱中，將OA和UA濃度為1.324 g/L的樣品液260  ml調(diào)成不同pH值(3，5，7，9，11)的溶液，在相同條件下進行動態(tài)吸附。結(jié)果表明，pH=7時打孔樹脂的吸附量*大。上柱液的pH過小，蒸餾水**步洗脫時便有三萜酸沉淀析出，大孔樹脂為非特異性吸附；上柱液的pH值過大，OA和UA形成鹽，在上柱液中溶解性能增強，也不利于樹脂吸附。

　　2.6  上柱液的濃度考察準確移取相同物質(zhì)量的OA和UA以不同濃度、相同流速通過裝有10 gX-5大孔樹脂的層析柱，測定流出液濃度（見表2）。當夏枯草樣品液的濃度為1.324g/L時，大孔樹脂的吸附量*大，所以選擇動態(tài)吸附的上樣濃度為1.324 g/L。表2  上柱液濃度對動態(tài)吸附的影響（略）

　　2.7  上柱液的流速對樹脂吸附量的影響將260 ml，1.324g/L的夏枯草上柱液調(diào)節(jié)pH=7，以不同流速(0.5 BV/h，1.0 BV/h，1.5 BV/h，2.0 BV/h，2.5BV/h)通過裝有10 gX-5大孔樹脂的層析柱，考察不同流速對樹脂吸附量的影響（見圖5）。X-5大孔樹脂對OA和UA的*佳吸附流速為1.0BV/h。流速過大，樹脂吸附率下降；流速過小則達到吸附平衡時間延長。

　　2.8 洗脫劑的選擇根據(jù)環(huán)保工藝的要求，采用乙醇水溶液為洗脫劑。由于X-5型樹脂為非極性大孔樹脂，故極性小的溶液洗脫能力強。因此洗脫時，先用極性較強的蒸餾水將非特異性吸附物質(zhì)（主要為多糖和一些雜質(zhì)）洗脫，然后由低到高用不同濃度乙醇溶液強其它成分洗脫，*后采用高濃度乙醇將目標組分洗下。本實驗以蒸餾水、30%，50%，70%，90%(V/V)乙醇溶液作為層析柱洗脫劑。

　　2.9  洗脫劑pH值對大孔樹脂解吸附的影響將夏枯草樣品液調(diào)節(jié)pH=7上柱，靜置480min后，依次用蒸餾水、30%，50%，70%(V/V)乙醇洗脫，再用pH=11的90%乙醇洗脫，測定洗脫液中OA和UA的含量。按同樣方法調(diào)節(jié)pH分別為7～13的90%乙醇洗脫，測定兩者的含量（如圖6）。洗脫劑的pH值越大，洗脫劑的洗脫能力越強。當pH=11時，洗脫率可以達到81.30%。原因可能是在解吸過程中，吸附的OA和UA與堿性洗脫劑發(fā)生反應(yīng)生成鈉鹽，導(dǎo)致大孔樹脂對兩者的吸附能力下降，鈉鹽較易進入洗脫液中。pH值繼續(xù)升高，洗脫率基本保持不變。因此，洗脫劑的pH值選擇在11左右。

　　2.10   動態(tài)解吸洗脫液流速的影響對吸附飽和的樹脂用pH=11，2.0BV的90%(V/V)乙醇以不同流速進行洗脫，實驗結(jié)果表明，流速越慢樹脂解吸效果越好，但太慢又會使工作周期延長，因此實驗選擇流速1.0BV/h。

　　2.11 動態(tài)吸附洗脫驗證綜合上述實驗結(jié)果，確定了X-5型大孔吸附樹脂富集純化夏枯草中兩種三萜酸的*佳工藝條件：采用1.324g/L夏枯草樣品液上柱，調(diào)節(jié)pH=7左右，室溫下以流速1.0BV/h吸附飽和；解吸時先用蒸餾水、30%，50%，70%(V/V)乙醇淋洗，*后用2.0BV，pH=11的90%(V/V)乙醇解吸，流速1BV/h。收集液調(diào)節(jié)pH=3后再加1倍量pH=3的蒸餾水后過濾，烘干濾渣，重結(jié)晶，按“1.3.2”項色譜條件測定其中OA和UA總含量，樣品中兩者總含量可達87.30%，收率為81.30%。HPLC測定混合OA，UA標準品及大孔樹脂洗脫前后的色譜圖見圖7(a～c)。

　　3  結(jié)論

　　X-5型大孔吸附樹脂能夠有效地富集純化夏枯草中兩種五環(huán)三萜酸成分，產(chǎn)品中目標組分的純度和收率較高，結(jié)果證明該工藝流程簡單易行。

　　*終產(chǎn)品中兩種三萜酸OA和UA共存，需經(jīng)制備色譜進一步分離得到單體。

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