掌握DNA印跡技術(shù)的基本原理，學(xué)習(xí)DNA印跡技術(shù)的操作方法，了解DNA印跡技術(shù)的應(yīng)用范圍。

【實(shí)驗(yàn)原理】

DNA印跡是1975年由英國(guó)Southern創(chuàng)建的。其基本原理是：DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，由瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子質(zhì)量大小分離，然后將DNA片段變性，并使凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜、硝酸纖維素膜(NC)或其他固相支持物上，此法中DNA片段由液流攜帶通過(guò)虹吸作用由下向上抽吸，從凝膠轉(zhuǎn)移印至濾膜表面。然后與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色來(lái)鑒定待測(cè)DNA分子。

DNA印跡技術(shù)主要用于對(duì)基因組DNA的定性和定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)等。

【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】

待測(cè)DNA。

【試劑與器材】

(1) 水平電泳裝置，電泳儀，紫外燈，搖床。

(2)待測(cè)DNA，瓊脂糖，溴化乙啶，DNA探針，保鮮膜，緩沖液。

(3) 0.25 mol/L HCl

(4) 變性液：1.5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L NaOH(保存于室溫)。

(5) 中和液： (pH 7.0) 5 mol/L NaCl; 0.5 mol/LTris-HCI (保存于室溫)。

(6) 轉(zhuǎn)移液 (20×SSC pH 7.0)：用800 ml H2O溶解175.3 gNaCl和88.2 g檸檬酸鈉，以濃 HCI調(diào)pH至7.0，用雙蒸水定容至1 L。分裝后高壓**。

(7) 2×SSC。

(8) 尼龍膜或硝酸纖維素 (NC) 膜。

【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】

(1) 取適量已酶切充分的待測(cè)DNA (1 μg左右)，于0.8%~1.25％的瓊脂糖凝膠上與合適的 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)一同進(jìn)行穩(wěn)壓電泳。

(2) 切去凝膠一角以標(biāo)記方向，用溴化乙啶染色后拍照記錄電泳結(jié)果(拍照時(shí)，凝膠旁放一尺子，便于以后對(duì)照電泳帶在膜上的位置) ，再切下一側(cè)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)帶。

(3) 處理凝膠以備轉(zhuǎn)膜。

1) 蒸餾水短暫漂洗凝膠(輕搖)。

2) 將凝膠浸沒(méi)入10倍于凝膠體積(約30min)的0.25mol/LHCl溶液中15~30min，使DNA脫嘌呤。蒸餾水短暫漂洗凝膠2次。

3)將凝膠浸沒(méi)入10倍體積的變性液中20min，2次，蒸餾水漂洗2次。

4) 將凝膠浸沒(méi)入10倍體積的中和液中20min，2次，使變性液被中和。

(4) 在制備雜交用膠時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移的平臺(tái)、膜、濾紙等。

(5) 安裝虹吸轉(zhuǎn)移裝置：如圖25-3所示，將一固體支持物置于盛有足以浸沒(méi)其一半高度的20×SSC的平皿中，依次將1張Whatman 3 mm濾紙橋，3張Whatman 3 mm濾紙，凝膠，疊放于固體支持物上，用塑料薄膜包裹凝膠邊緣后，將1張?jiān)谡麴s水中平衡過(guò)的尼龍膜(或用蒸餾水浸濕，然后在20×SSC中平衡10min的NC膜)，5張Whatman3mm濾紙及一疊4cm紙巾塔依次置于凝膠的上部，再放一玻璃板，其上壓重物(注意：凝膠與轉(zhuǎn)印膜間應(yīng)避免有氣泡，濾紙、吸水紙巾等必須大小一致)。轉(zhuǎn)移持續(xù)4h以上或過(guò)夜，勿使轉(zhuǎn)移液干枯。

(6)使已轉(zhuǎn)移的DNA與膜交聯(lián)：取出轉(zhuǎn)印膜，用鉛筆在膜上標(biāo)記樣品孔的位置，并切去一角以標(biāo)示方向。用2×SSC漂洗轉(zhuǎn)印膜，然后將其放在一張Whatman3mm濾紙上，有DNA的一面朝上，使其完全干燥。再將膜置于UVcrosslinker中，在紫外光下自動(dòng)交聯(lián)或?qū)C轉(zhuǎn)印膜置于可透過(guò)紫外線的塑料夾層中，帶有DNA的一面朝下，置于紫外透射儀(波長(zhǎng)在254nm)上，以合適的照射強(qiáng)度進(jìn)行紫外線交聯(lián)，以固定DNA。

(7) 用蒸餾水短暫的漂洗已交聯(lián)的膜后，將其夾于2張Whatman 3mm濾紙之間，80℃真空干烤2h或空氣干燥。轉(zhuǎn)印膜干燥后可夾在2張Whatman3mm濾紙之間，室溫下放置數(shù)月。備做核酸雜交實(shí)驗(yàn)。

SouthernBlot僅僅是將待測(cè)DNA片段從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移并固定到固相支持物上，要實(shí)現(xiàn)DNA探測(cè)還需完成核酸雜交實(shí)驗(yàn)（包括探針標(biāo)記、雜交和檢測(cè)三個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟）。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和探針，二者按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。探針是用于檢測(cè)的已知核酸片段，根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為放射性(同位素)標(biāo)記探針和非放射性(非同位素)標(biāo)記探針。放射性標(biāo)記的探針，是在探針制備過(guò)程中摻入32P-dNTP而實(shí)現(xiàn)放射性標(biāo)記的。非同位素標(biāo)記物有生物素(biotin)、地高辛(dig-oxigenin，Dig)和熒光素(Fluorescein)等。待測(cè)核酸與探針雜交后，通過(guò)放射自顯影、化學(xué)顯色或直接在(熒光)顯微鏡下觀察雜交信號(hào)來(lái)鑒定待測(cè)核酸分子的大小及含量(方法見(jiàn)第六節(jié)后附錄一和附錄二)。

【注意事項(xiàng)】

(1)在分辨核酸電泳帶所需的凝膠濃度范圍內(nèi)，電泳中使用的瓊脂糖凝膠的濃度越低越好，并且厚度應(yīng) ≤7mm。轉(zhuǎn)印前切去凝膠多余的邊緣，因?yàn)槟z邊緣多比凝膠本身要厚，與濾膜很難緊密相貼。

(2)電泳結(jié)束后，應(yīng)在紫外檢測(cè)儀下仔細(xì)觀察酶切是否完全、電泳分離效果是否良好、DNA樣品有無(wú)降解、樣品量是否一致、是否有因電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻?qū)е聵悠穾в緞?dòng)速度不一致等。

(3)戴手套以防手受酸堿溶液損傷，同時(shí)避免污染濾膜。取拿濾膜時(shí)使用平頭鑷子。

(4)在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，如吸水紙巾全部潤(rùn)濕需及時(shí)更換，否則會(huì)造成緩沖液的逆流。

(5) DNA片段的大小決定其轉(zhuǎn)移速度。小于1kb的DNA片段，1h即可完成轉(zhuǎn)移過(guò)程。大片段DNA的轉(zhuǎn)移速度和效率則慢得多，如大于15kb的DNA片段需要18h以上。因此，當(dāng)DNA片段長(zhǎng)度大于15kb時(shí)需進(jìn)行脫嘌呤(稀鹽酸)及強(qiáng)堿水解處理，使之降解成較小的片段，從而提高轉(zhuǎn)移效率。