有關(guān)如何使得介質(zhì)獲得*佳結(jié)果，Whatman公司已為蛋白質(zhì)、酶和核酸片斷等生物多聚物的有效分離特別開發(fā)了一系列Whatman離子交換纖維素。在使用時只有確實按注意事項操作才能得到*佳結(jié)果。

介質(zhì)種類

交換劑的預處理

1．預溶脹（51，52和53型）型離子交換劑不用預先反復處理就可使用。但必須用緩沖液使充分平衡。預溶脹的離子交換劑在每次預處理或再生后使用時不要用任何方法使它變干。

2．為了得到盡可能好的結(jié)果，對干的離子交換纖維素（23和32型）預處理的每一步必須按下面將介紹的那樣進行操作。

3．DE51、QA52、SE52和SE53含防腐劑。它會在平衡和裝柱時自動隨之除去。如果離子交換劑還進行平衡，防腐劑可以用蒸餾水或脫離子水洗滌。

**部分  干型離子交換纖維素

預處理

1．稱重的離子交換劑加到15倍容積（W/V）酸或堿液中輕輕攪動，進行**次處理。

2．微粒產(chǎn)品至少浸留30分鐘，纖維狀產(chǎn)品浸60分鐘。

3．濾出或潷出上清液，用水洗至下列“中間pH”。

4．再用15倍容積的二次處理用酸或堿液浸泡交換劑，放置30分鐘，濾出上清液。

5．重復上述“4”二次處理，然后用水洗至洗液呈中性。

處理條件

注意：對預溶脹的微粒狀產(chǎn)品（51.52和53型）不需進行這一步，因此干型產(chǎn)品用在大規(guī)模柱分離更好。

**部分  預溶脹型離子交換纖維素和預處理后的干型離子交換纖維素

交換劑懸液的準備

一般QA52型和SE52型全離子化交換劑在用低離子濃度緩沖液平衡時比DE52和CM52型處理時間更短就可達平衡。

而且所有介質(zhì)當采用的緩沖離子是共有離子時所需平衡容積*少，也就是與離子交換劑相一致的緩沖液，例如采用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（TrisHCl buffers）對DE或QA型離子交換劑平衡所需時間和容積都要比用醋酸鹽類緩沖液少。

所有情況下實際采用的起始緩沖液濃度比需要的起始緩沖液濃度高（典型的高10倍），這樣有利于交換劑的預平衡。下面介紹的是更可取的平衡方法。

離子交換劑裝柱后在進樣品前必須用低離子濃度的緩沖液進行平衡，通常將2～4倍柱床容積的低濃度緩沖液通過填充柱就可完成平衡。

推薦的方法

1.在使用之前用緩沖液的濃溶液（0.2－1.0M）輕輕搖動攪起離子交換劑2－3分鐘。*初取干型纖維素時每克干品約用15～30ml緩沖液，濕離子交換劑約用6ml/g

2.在攪動下緩沖液的酸或堿成分使緩沖液/離子交換劑懸液的pH調(diào)到所希望的值。

3．讓懸液沉降并傾出上清液中的細小子。

4．再次用緩沖液使離子交換劑松散。干型離子交換劑懸液的總?cè)莘e按30ml/g計，濕離子交換劑約為6ml/g.

5.離子交換劑和緩沖液的懸液在合適的量筒中沉降，并置于無灰塵、無直射陽光和不發(fā)熱的地方。沉降時間可按t=nh式計算。式中：t=時間（分）， h=量筒中懸液總高度（公分），n=系數(shù)可取1.3~2.4。

6.注意“濕沉降容積”是離子交換劑在規(guī)定條件下沉降后所占容積。除去上清液中所含細粒后留在量筒中的*終容積是“濕沉降容積”加20％。

填裝短柱或長柱時懸液可以選用上述密度，但是纖維狀產(chǎn)品的長柱床的密度需用“濕沉降容積”加50％

變換緩沖液可用方法

1．按上項（1）那樣輕輕攪起離子交換劑到一定容積的緩沖液中。

2．放置10分鐘，傾出或濾出上清液。

3．重復處理直到濾液或上清液確實與緩沖液的PH和電導率一樣為止。變換緩沖液后必須核對PH等。當采用低濃度緩沖液時本方**有所變化，且需要增加處理的時間。

4．除去細顆粒和裝柱的準備工作請按上述（4）（5）和（6）項進行。

裝柱

在裝柱時必須避免離子交換劑和緩沖液懸液的對流翻動。

為此必須使懸液倒入柱中瞬間離子交換劑形成沉降柱床層，操作進行得盡可能快，否則懸液中的對流需很長時間才會停下來。

1、離子交換用柱應垂直置于無灰塵、無直射陽光和不發(fā)熱等環(huán)境中。

2、假如懸液容積大于柱容積時應接一段延長管。

3、輕輕攪動下將懸液倒入柱中。

4、讓洗脫液從柱中排出。

5、全部懸液加完后裝上或插入柱頂蓋。

6、緩沖液用泵或流動法通過柱，流速控制至少45ml/hr/cm2柱內(nèi)截面積，直到柱床高度恒定。

7、停止緩沖液流進或流出柱。

8、取下延長管（若裝著）并換上柱頂蓋。

平衡

需強調(diào)的是必須正確讀取pH和電導率。

對真正的平衡而言平衡后的溶液應與起始緩沖液一致。必須做倒不僅連續(xù)兩次平衡溶液的讀數(shù)相同，而且要與起始緩沖液相同。不正確的平衡常是產(chǎn)生無重現(xiàn)性結(jié)果的原因。

起始緩沖液流過柱直到流出液的電導率和pH**地與起始緩沖液相同。此方法適于開始時用低濃度緩沖液的柱分離。

樣品準備和加樣

樣品溶于起始緩沖液中并調(diào)整溶液的pH。細胞提取物和硫酸銨沉淀物要用層柱起始緩沖液透析。這一步不注意就有可能得到無法重現(xiàn)的結(jié)果?；旌衔锿ǔＴ诳刂屏魉傧录拥街?。

洗脫

加樣品后立刻開始洗脫或在規(guī)定時間下開始。

通常有三種方法層析分離。有分步洗脫，連續(xù)梯度洗脫和分段梯度洗脫。

分步洗脫

離子交換劑平衡和樣品混合物準備時所用緩沖液也可在洗脫時用，洗脫可以兩種方式完成：

1．目的物分子是游離狀態(tài)的。所需離子交換劑量要根據(jù)混合物污染程度、結(jié)合力和成分而定。柱床高度在這種方式操作并不重要。

2．目的物分子是結(jié)合狀態(tài)的。層析時混合物是由相類似的成分組成的，為了獲得*佳操作應選用相對長些的柱?？扇〉氖侵挥昧酥?cè)萘康暮苄∫徊糠郑ㄈ?%）。

應避免離子交換劑平衡和柱中層析分離兩者選用不同的緩沖液，除非系統(tǒng)已經(jīng)明確顯示出會得到錯誤的結(jié)果時才考慮。

梯度洗脫

連續(xù)地或分段地改變緩沖液的組分用于有效分離。緩沖液的組分變化可以是提高一種離子濃度或改變適當?shù)膒H，或者兩者都改變。緩沖液本身是達到分離目的的主要因素，離子交換劑的量需要按離子交換劑對目的化合物的交換容量而定。萬一混合物含層析相近似的組分時，為了獲得好的分辨力需要增加些柱的長度。

特殊技術(shù)

**

所有Whatman離子交換介質(zhì)除P11型之外為了**都可以高壓**，*好是離子交換劑用pH6.5-7.5的非揮發(fā)性緩沖液配成的懸液中進行。

建議的**條件是10psi 15分鐘，或15psi10分鐘。另外除P11型之外所有的產(chǎn)品也可以用化學**法，將介質(zhì)分散在0.5M NaOH中，然后用**水洗滌。所有產(chǎn)品也可用含20~25%體積百分比的乙醇水溶液處理。

脫氣（對陰離子交換劑）

對大多數(shù)靈敏的分離，為了獲得重現(xiàn)性好的結(jié)果，DE和QA纖維素交換劑需除去吸附的二氧化碳。假如懸液預先按上述推薦的方法處理過后一般就不必進行這一步。

1.     將纖維素加到酸性緩沖液中。

2.     調(diào)整pH在4.5。有時甚至要用更高濃度的酸溶液來調(diào)節(jié)pH。

3.     在攪拌下抽真空（壓力降至10cmHg以下）直到?jīng)]有更多的氣泡產(chǎn)生，在不產(chǎn)生沸騰之后停止真空。較合適的是在抽濾瓶中帶磁力攪拌器攪拌下進行，抽濾瓶與吸氣器相連。

4.     加堿性緩沖液使達所希望的pH。對要求更高的分離，所用緩沖液必須用除CO₂和水配置以保證無CO₂。

采用含醇緩沖液

對SE53型介質(zhì)需用含醇緩沖液，平衡時先用水緩沖液處理，然后再用含醇緩沖液系統(tǒng)完成平衡。

分批法離子交換

1，將一定量的已預處理并平衡過無細粒的離子交換劑加到原溶液中。

2，按原溶液中所含成分的容量攪動一定時間進行吸附分離。

3，用過濾法或離心法將離子交換劑和緩沖液分開。

4，用平衡時所用緩沖液洗滌離子交換劑。

5，在攪動流化床下或離心下解吸，也可以將纖維素裝柱后用上述洗脫技術(shù)進行解吸。

有關(guān)Whatman 離子交換纖維素介質(zhì)大規(guī)模分離應用請與Whatman 國際公司聯(lián)系。公司聯(lián)絡地址：SpringfieldMill ,Maidstone,Kent.ME142LE,England.

Whatman 離子交換介質(zhì)的在位清洗方法

在許多運作中，Whatman 分離介質(zhì)能多次使用。為保持其再生的水平，建議采用下述在位清洗的方法：

1. 用2柱子容量的0.5M濃度的氫氧化鈉溶液清洗，并在室溫下浸泡12小時；

2. 用2柱子容量的除礦質(zhì)水清洗；

3. 用2柱子容量的四倍濃度的起始緩沖液清洗；

4. 用6柱子容量的起始緩沖液平衡柱子。

上述清洗過程種可**吸附在柱內(nèi)的蛋白質(zhì)和類脂物，并不會影響層析的特性或介質(zhì)的穩(wěn)定性。介質(zhì)的**亦在此過程中得以完成。即使對嚴重污染的介質(zhì)亦是有效的。

如果上述清洗未能產(chǎn)生效果，可用濃度較高的氫氧化鈉溶液（可達2M NaOH）。在這種情況下，介質(zhì)與氫氧化鈉接觸的時間可以減小。

貯藏方法：

如果介質(zhì)需要貯藏亦個較長的時間，可采用下述方法以確保產(chǎn)品的特性。

在柱內(nèi)或象散裝泥漿似的貯藏離子交換纖維素，建議用下述抑菌劑，pH范圍為3－11：

基團                                    建議用抑菌劑

DE或QA                 0.2％W/V    Benzalkonium Chloride

CM或SE                 0.1%W/V    疊氮鈉或

                               0.1%W/V    二硫雙（吡啶－N－氧）或

                                0.02％W/V  硫柳汞

P11                          0.1%W/V    二硫雙（吡啶－N－氧）

證書：

Whatman 所有型號的離子交換介質(zhì)都已獲得美國食品和**管理局（FDA）頒發(fā)的DMF（Drug MasterFile）證書。如：

      DMF11103                   快速離子交換介質(zhì)D            

      DMF11102                   快速離子交換介質(zhì)Q

      DMF11101                   快速離子交換介質(zhì)S

      DMF11100                   快速離子交換介質(zhì)C

因此，若需要藥證生產(chǎn)的產(chǎn)品，Whatman 離子交換介質(zhì)能容易地獲準用于**生產(chǎn)業(yè)的層析分離。