摘要：目的 建立金銀花中綠原酸的色譜分離純化方法．方法采 用親脂性吸附樹脂與葡聚糖凝膠色譜純化技術(shù)，將其水提物經(jīng)親脂性吸附樹脂柱色譜預(yù)分離后，0.1mol/L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.0左右，葡聚糖凝膠sephadexLH-20精制純化，洗脫溶劑為5O%丙酮水溶液．結(jié)果產(chǎn)品經(jīng)MS、紅外、紫外和HPLC圖譜鑒定，并與對(duì)照品比較對(duì)照，結(jié)果顯示所得的綠原酸純度>98％．結(jié)論該方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，可用于綠原酸單體成分的制備．
關(guān)鍵詞：綠原酸；金銀花；分離純化；聚酰胺；葡聚糖凝膠
0 前言
綠原酸(Chlorogenic acid，化學(xué)名3-0-caffeoylquinic acid)，是由咖啡酸和奎寧酸組成的縮酚酸，屬于苯丙素類化合物，廣泛分布忍冬科、薔薇科、菊科、茜草科合杜仲科等植物中，是杜仲、金銀花等傳統(tǒng)中藥****、****的主要藥效成分．
綠原酸的分布、提取和生物活性已有相關(guān)的報(bào)道．目前已有的提取分離方法有β-CD包合、無機(jī)鹽沉淀、酶法和制備型高效液相色譜法等，劉世名等采用polyamideSC-6分離純化、LC-MS聯(lián)用技術(shù)鑒定牛蒡葉中的綠原酸．已有的方法存在分離步驟繁瑣、工藝復(fù)雜、設(shè)備成本過高等不足，*終產(chǎn)品不能作為對(duì)照品使用．本文提出一種聚酰胺前處理結(jié)合sephadex LH-20凝膠色譜純化金銀花中綠原酸的方法，得到的產(chǎn)品純度大于98%．該法穩(wěn)定、快速、高效，解決了新藥開發(fā)中綠原酸對(duì)照品的制備問題．
1 實(shí)驗(yàn)部分
1．1 儀器與試劑
Waters高效液相色譜儀，包括：2487紫外-可見光分光光度檢測(cè)器，515液相色譜泵，Rheodyne7725i型手動(dòng)進(jìn)樣器，Millennium 2010軟件．蠕動(dòng)泵，自動(dòng)餾分收集器．Agilent1100 HPLC MS聯(lián)用儀．
金銀花藥材(其中綠原酸的含量為3%)由同仁堂藥店提供，對(duì)照品(純度大于98%)由中國藥品生物檢定所提供．
甲醇(色譜純)、乙醇、丙酮、冰醋酸、鹽酸和氫氧化鈉(分析純)，流動(dòng)相和溶液配制均使用石英亞沸蒸餾器的二次蒸餾水．
1．2 色譜分析條件
色譜柱為symmetry RP18柱(150mm ×3.9mm i．d．、5μm )，流動(dòng)相為甲醇-水(40：60)，含1%(V／V)冰醋酸；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)325nm；進(jìn)樣體積2OμL．
1．3 實(shí)驗(yàn)方法
1．3．1 檢測(cè)方法的建立
1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備**稱取綠原酸對(duì)照品2.4mg置于50mg量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度，搖勻，得每1mL含0.048mg的對(duì)照品溶液．
2)線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于10mL量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度．精密吸取上述對(duì)照品溶液2OμL，注入色譜儀，測(cè)得色譜峰面積．以進(jìn)樣量C(μg)對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸（n=5），得回歸方程A=3025147C一587329(r=0.998)．結(jié)果表明，綠原酸在進(jìn)樣量0.096～0.48 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系．
3)精密度試驗(yàn)對(duì)照品和樣品溶液各2OμL，按色譜條件分別重復(fù)進(jìn)樣1O次(每次20μL)，測(cè)定色譜峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.9 0／0和1.7%。
4)穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液2OμL，分別于0、2、4、6、8、10、12h注入色譜儀，按色譜條件測(cè)得色譜峰面積·其RSD為1.5 %．同時(shí)對(duì)樣品重復(fù)上述試驗(yàn)，RSD為2.3%，表明對(duì)照品和供試品在12h之內(nèi)穩(wěn)定．
5)重復(fù)性試驗(yàn)在同日內(nèi)和不同日期，取同一批樣品，分別由不同操作者，制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸的含量5次，其日內(nèi)RSD為1.8%，日間的RSD為2.9%，表明重復(fù)性好．
1．3．2 pH穩(wěn)定性試驗(yàn)
用0.1mol/L 的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)綠原酸提取液的pH至3～8之間，盛于棕色瓶中，4℃冰箱中待測(cè)．
1．3．3 樣品分離純化
**次采用95%乙醇、后兩次采用5O%的乙醇水溶液，固液比均為1：1O，調(diào)節(jié)溶液的pH約為3，5O℃左右提取3次．合并提取液，濃縮至無醇味，4℃ 冰箱冷藏過夜，抽濾得上清液，待用．酸、堿、醇處理好的聚酰胺樹脂裝于玻璃柱(400×10mm)中，緩慢加入上步上清液至流出液變渾濁，依次用水、10%、2O%、3O%、4O%和5O%乙醇水溶液(鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0左右)梯度洗脫，HPLC檢測(cè)合并綠原酸含量大于6O%的洗脫液，濃縮后置于0℃冰箱中析晶，抽濾．上述晶體溶于適量水中，加于SephadexLH-20柱柱頂．層析條件為洗脫劑5O%的丙酮水溶液(pH-4)、流速0.5mL/min．自動(dòng)餾分收集器收集，HPLC檢測(cè)，合并綠原酸洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥得綠原酸純品．
2 結(jié)果與討論
2．1 HPLC條件和檢測(cè)方法
HPLC為常用的定性定量分析方法．由于綠原酸溶于水后有部分解離，導(dǎo)致檢測(cè)色譜峰拖尾和分析結(jié)果重現(xiàn)性差等問題，因此有必要在流動(dòng)相中添加酸性物質(zhì)，抑制綠原酸的解離．檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)證明1的冰醋酸改性的流動(dòng)相可以有效的分析綠原酸成分．
2．2 pH穩(wěn)定性分析
文獻(xiàn)報(bào)道[8]，光照或加熱條件導(dǎo)致綠原酸的分解．其原因可能為綠原酸結(jié)構(gòu)中的羧酸基團(tuán)或鄰二酚羥基易于發(fā)生反應(yīng)．HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，綠原酸提取液的pH值處于3-5時(shí)，綠原酸比較穩(wěn)定．表明在這種情況下綠原酸的含量不隨時(shí)間的變化而降低．
2．3 聚酰胺樹脂的梯度洗脫分離
在各個(gè)梯度乙醇洗脫液中，綠原酸集中出現(xiàn)在3O%乙醇的洗脫液中．為了增加綠原酸與提取液中其他雜質(zhì)成分的分離度，結(jié)合穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)洗脫液的pH至4左右．
推測(cè)在這種情況下，綠原酸分子處于未解離狀態(tài)，吸附在聚酰胺樹脂的表面，2O%及其以下的乙醇水洗脫液中不含有綠原酸成分，3O%的乙醇水溶液可以洗脫，同時(shí)雜質(zhì)含量明顯降低，綠原酸的純度大于6O%，此時(shí)的回收率大于7O%．
2．4 sephadex LH-20純化
經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)分析，選擇pH(3、4和5)，洗脫劑(50%甲醇水、5O%乙醇水和5O%丙酮水)，流速(O.5mL/min、1.0 mL/min和1.5mL/min做如下正交實(shí)驗(yàn)．
經(jīng)過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，*優(yōu)的分離條件為：pH為4、洗脫劑為5O%的丙酮水溶液和流速0.5mL/min．經(jīng)過一次sephadex LH-2O分離，得到純度98%以上的綠原酸108mg．
2．5 結(jié)構(gòu)鑒定
純化得到的白色針晶，HPLC測(cè)定為一單峰，nm：329.7.IR/cm：3362(-OH)、1726(C=O)、1687、1640、1601、1289、1191、969、818．ESI／MS m/z：377.2[M+Na]+，353.2[M-H]-，與標(biāo)準(zhǔn)品比較結(jié)果一致．推斷該化合物確為綠原酸．
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