朱靖蓉1，王忠民2，李瑾瑜1，馬興旺3
（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊  830052；2 新疆食品藥品監(jiān)督管理局，烏魯木齊 830002；
3 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院，烏魯木齊  830091）

摘 要：本文以脫脂葡萄籽為原料從中提取原花青素，研究用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)原花青素分級(jí)純化方法，以及純化的原花青素產(chǎn)品**超氧陰離子自由基、亞油酸體系的抗氧化等方面的抗氧化活性。結(jié)果顯示：ADS-8大孔樹(shù)脂對(duì)葡萄籽原花青素具有較強(qiáng)的吸附能力，得到的產(chǎn)物純度達(dá)95％以上，是分離葡萄籽原花青素較理想的吸附劑；20％和40％的乙醇原花青素洗脫液具有很強(qiáng)的**O2-·的能力，抑制鄰苯三酚自氧化率分別達(dá)88.35％和67.2％，說(shuō)明葡萄籽原花青素為抗自由基的有效活性成分；在亞油酸體系中，OPC’s的抗氧化能力高于VC和VE。
關(guān)鍵詞：葡萄籽；原花青素；大孔吸附樹(shù)脂；自由基

原花青素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的*有效的自由基**劑之一，它對(duì)近70多種**具有直接或間接的預(yù)防**作用，具有廣泛的生化和藥理活性，在醫(yī)藥、化妝品及保健食品等領(lǐng)域具有廣泛的用途［1］。原花青素廣泛存在于各種植物（如葡萄、銀杏、白樺樹(shù)、可可豆等）的核、皮或種籽中，大多數(shù)原花青素產(chǎn)品從各種植物中提取，但多數(shù)的原花青素含量比較低。目前普遍認(rèn)為葡萄籽是提取原花青素的較好來(lái)源［2，3］，但葡萄籽提取物是多酚（polypheno1）類黃酮，由單體（兒茶素、表兒茶素等）、基于此單體的聚合物（原花青素proanthocyanidln）和其它酚類組成。這一組成分中生物活性*強(qiáng)的部分是低聚（二，三聚體）原花青素，即OPCs（oligomericproanthocyaniditns)［4］。在葡萄籽提取物中OPCs含量高低就成為產(chǎn)品質(zhì)量的*關(guān)鍵指標(biāo)。葡萄籽粗提物中原花青素含量較低，需進(jìn)一步分離純化。在各種分離方法中，由于近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的大孔吸附樹(shù)脂吸附洗脫法具有選擇性好、吸附容量大、再生處理方便，及吸附迅速、解吸容易等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物工業(yè)化提取分離中得到廣泛應(yīng)用。本文以葡萄籽為原料從中提取原花青素，并選用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)自制的原花青素進(jìn)一步吸附、洗脫分離，進(jìn)行純化，就純化后的原花青素產(chǎn)品在不同體系中**自由基的活性進(jìn)行研究，探索提取高純度原花青素的方法，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用原花青素提供參考。
1  實(shí)驗(yàn)材料
1.1  實(shí)驗(yàn)儀器
Waters公司高壓液相色譜儀，HHS型電熱恒溫水浴鍋，SHZ-82水浴恒溫振蕩器，UV-2100紫外／可見(jiàn)分光光度儀，ZFQ-85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)。
1.2  實(shí)驗(yàn)材料
AB-8、ADS-8和S-8型大孔樹(shù)脂；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（濃度≥95％），購(gòu)自天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司；葡萄籽是新疆葡萄酒廠下腳料；亞油酸（不含抗氧化劑，含量≥90％）由本實(shí)驗(yàn)室用紅花油提?。还I(yè)級(jí)乙醇、Tris（三羥甲基氨基甲烷）及所用其他化學(xué)試劑均為分析純。
2  實(shí)驗(yàn)方法
2.1  葡萄籽原花青素粗提方法
稱取10.000g經(jīng)石油醚脫脂葡萄籽粉（40目），用體積分?jǐn)?shù)70％的乙醇溶液攪拌提取3次，合并提取液，離心過(guò)濾，得澄清的濾液。濾液在40℃以下減壓濃縮，經(jīng)真空干燥，得葡萄籽原花青素粗提物。此樣品用于靜態(tài)吸附及解吸性能試驗(yàn)。
2.2  原花青素含量分析方法
采用鹽酸—香草醛法［5，6］，以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中原花青素含量。
2.3  大孔樹(shù)脂篩選
2.3.1  靜態(tài)吸附量及解吸率的測(cè)定
準(zhǔn)確稱取吸附樹(shù)脂2g，用少量乙醇濕潤(rùn)后，以蒸餾水洗去乙醇，再吸干其表面水分后置于150ml三角瓶中，加入40ml原花青素溶液（15mg／ml），置于水浴搖床，30℃，120r／min振蕩36h后過(guò)濾，再用100ml95％乙醇洗脫樹(shù)脂，分別測(cè)定濾液及洗脫液中原花青素總量，計(jì)算樹(shù)脂的吸附量及解吸率。
2.3.2  ADS-8樹(shù)脂的吸附流出曲線與解吸曲線的繪制
處理后的ADS-8樹(shù)脂于水中濕法裝柱，玻璃柱  Ｏ11.9×42cm，其中樹(shù)脂裝填高度32cm，床體積約90ml。將葡萄籽原花青素粗提物用水稀釋至原花青素濃度分別為5.8、15.0mg／ml，以2ml／min流速上樣分步收集流出液（10ml／管），測(cè)定其中原花青素濃度。以流出液體積（BV）為橫坐標(biāo)、流出液中原花青素濃度C與進(jìn)樣原花青素濃度C0之比（C／C0）為縱坐標(biāo)，繪制吸附透過(guò)曲線。
當(dāng)流出液中原花青素濃度達(dá)進(jìn)樣濃度的1／10時(shí)認(rèn)為已達(dá)到吸附的穿透點(diǎn)，停止進(jìn)樣，計(jì)算吸附通量。達(dá)吸附通量后的樹(shù)脂，先以4BV去離子水洗柱，后用一定濃度的乙醇解吸，流速2ml／min，分步收集洗脫液，測(cè)定其中原花青素濃度，以洗脫液體積（BV）為橫坐標(biāo)、洗脫液中原花青素濃度（mg／ml）為縱坐標(biāo)，繪制解吸曲線。
2.4  葡萄籽原花青素的層析純化及分級(jí)提取
用體積分?jǐn)?shù)10％、20％、40％、50％、70％的乙醇溶液進(jìn)行解吸，流速2BV／h，洗脫體積3BV。將洗脫液真空濃縮，得到葡萄籽原花青素純化物濃縮液。
2.5  研究葡萄籽原花青素**自由基活性的方法
2.5.1  **O2-·自由基試驗(yàn)
在試管1中加入2.8ml Tris-HCl溶液、0.1ml水和0.1ml的0.01 mol HCl，在試管2中加入2.8mlTris.HCl溶液、0.1ml 0.01molHCl，在試管3中加入2.8mlTris－HCl溶液、0.1ml水，在試管4中加入2.8mlTris-HCl溶液，將試管1～4、鄰苯三酚溶液、2.4中提取原花青素溶液于25℃保溫20min。然后以試管1作為參比，取0.1ml原花青素溶液加入到試管2中，迅速搖勻，420nm處測(cè)量吸光值A(chǔ)1；取0.1ml鄰苯三酚溶液加入到試管3中，迅速搖勻，每隔30s測(cè)一次420nm處吸光值A(chǔ)2；分別取0.1ml原花青素溶液和0.1m1鄰苯三酚溶液加入到試管4中，迅速搖勻，每隔30s測(cè)一次420nm處吸光值A(chǔ)3。按下式計(jì)算各樣品對(duì)O2-·的**率I（％）。
2.5.2  原花青素對(duì)亞油酸體系抗氧化能力的檢測(cè)——硫氰酸鐵法（FTC法）
取1ml已溶解于無(wú)水乙醇的樣品溶液，加入1ml含2.51％（V／V）亞油酸的無(wú)水乙醇溶液，2ml0.05M、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，1ml蒸餾水，密封后40℃恒溫避光氧化，以乙醇代替抗氧化劑做空白對(duì)照。
過(guò)氧化值的測(cè)定采用硫氰酸鐵法：取0.1ml亞油酸乳化液，依次加入9.7ml 75％的乙醇和0.1ml30％的硫氰酸氨，再加入0.1ml0.02M溶解于3.5％鹽酸的氯化亞鐵，快速混勻，反應(yīng)3min后測(cè)定500nm吸光度，以A500nm表示亞油酸氧化程度，0時(shí)刻測(cè)定，以后每隔24h測(cè)定一次，扣除0時(shí)刻值即為t時(shí)刻過(guò)氧化值。各樣品的抗氧化能力以192h時(shí)的氧化程度按下式計(jì)算，以抑制率（％）表示：
3  結(jié)果與分析
3.1  三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)原花青素靜態(tài)吸附及解吸性能比較
由表1中吸附量看，AB-8、ADS-8和S-8型樹(shù)脂均對(duì)原花青素具有相對(duì)較強(qiáng)的吸附能力。但從解吸效果來(lái)看，S-8樹(shù)脂對(duì)原花青素的解吸回收率很低，很難再洗脫下來(lái)。而ADS-8樹(shù)脂不僅對(duì)原花青素吸附量高、解吸率高，對(duì)原花青素的選擇性較強(qiáng)而且能夠較容易地解吸下來(lái)。所以，從吸附與解吸特性綜合衡量，ADS-8樹(shù)脂優(yōu)于其它二種吸附樹(shù)脂，是分離葡萄籽原花青素較理想的吸附劑，可用于原花青素的層析分離。
圖1顯示，濃度分別為5.8、15.0mg／ml的原花青素水溶液通過(guò)ADS-8樹(shù)脂時(shí)，吸附通量分別為8.7、3.9BV，即ADS-8樹(shù)脂對(duì)原花青素吸附量分別為53、58.5mg／g樹(shù)脂，表明一定范圍內(nèi)原花青素的進(jìn)樣濃度越高，樹(shù)脂的吸附量越大。
表1  三種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)原花青素靜態(tài)吸附量及解吸率
 樹(shù)脂 吸附量（mg/g樹(shù)脂） 解吸率（%）
 ADS-8 101 96.7
 AB-8 89 96.3
 S-8 126 29.4

3.2  ADS-8樹(shù)脂的解吸特性
用不同濃度的乙醇溶液梯度洗脫ADS-8樹(shù)脂吸附的原花青素時(shí)，原花青素解吸曲線均出現(xiàn)明顯的峰值（圖2），而且峰形比較集中，說(shuō)明不同濃度的乙醇對(duì)原花青素的洗脫具有選擇性，即一定濃度的乙醇能夠選擇性地洗脫具有相近性質(zhì)的原花青素。在2ml／min的流速下，4BV40％樹(shù)脂吸附的原花青素被洗脫時(shí)，一些非黃烷三醇類雜質(zhì)在此乙醇濃度下不會(huì)被洗脫，從而可以選擇性地洗脫得到高含量的原花青素［7］，其洗脫峰形也比較集中，4～5BV也基本可以洗脫此乙醇濃度下所能洗脫的原花青素。經(jīng)ADS-8大孔樹(shù)脂層析分離，原花青素的純度可達(dá)95％。
3.3  原花青素的梯度洗脫效果
從表2看，50％的乙醇可以較完全地將吸附在ADS-8樹(shù)脂上的原花青素解吸下來(lái)，這在工業(yè)生產(chǎn)中是可行的。70％的乙醇已經(jīng)基本能夠洗脫吸附于樹(shù)脂上的絕大部分固形物，可以用于樹(shù)脂柱的初步再生。這充分證明了樹(shù)脂法分離原花青素時(shí)簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)。
表2  不同濃度乙醇對(duì)ADS-8樹(shù)脂吸附原花青素的解吸率
         乙醇濃度（%）              解吸率（%）
 10 5.5
 20 76.9
 40 90.6
 50 97.5
 70 97.8

3.4  純化的原花青素**超氧陰離子自由基O2·能力
從圖3看出，原花青素粗提取物經(jīng)ADS-8大孔樹(shù)脂層析分離，不同濃度乙醇溶液洗脫得到的純化原花青素**超氧陰離子自由基O2·的能力不同，20％乙醇洗脫液抗氧化活性*強(qiáng)。當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度達(dá)到10mg／ml時(shí)，**率達(dá)到88.35％，說(shuō)明葡萄籽原花青素為抗自由基的有效活性成分。
3.5  原花青素對(duì)亞油酸體系的抗氧化能力
亞油酸乳化體系是用以檢驗(yàn)抗氧化劑在食品體系中抗氧化作用的*常用的體系。圖4是高聚和低聚原花青素對(duì)亞油酸體系氧化抑制率（原花青素抗氧化性）分別為93.04％和76.88％，而同濃度的VC及VE抑制率分別為35.52％和64.28％。在所研究的兩種聚合度下原花青素抗氧化效果低于BHT，但與空白對(duì)照相比，10μg／ml濃度時(shí)原花青素對(duì)亞油酸乳化體系的抗氧化效果已很明顯，而且其抗氧化效果在一定范圍內(nèi)隨濃度的增加而增強(qiáng)，在實(shí)際應(yīng)用中可以通過(guò)適當(dāng)增加其添加量而達(dá)到與BHT相近的抗氧化效果。
4  結(jié)論
（1）ADS-8大孔樹(shù)脂對(duì)葡萄籽原花青素具有較強(qiáng)的吸附能力，得到的產(chǎn)物純度高，是分離葡萄籽原花青素較理想的吸附劑。
（2）不同濃度的乙醇對(duì)原花青素的洗脫具有選擇性，即一定濃度的乙醇能夠選擇性地洗脫具有相近性質(zhì)的原花青素，能夠分離出生物活性*強(qiáng)的部分低聚原花青素，乙醇溶液是較好的原花青素洗脫液。
（3）20％和40％的乙醇原花青素洗脫液具有很強(qiáng)的**O2·的能力，抑制鄰苯三酚自氧化率分別達(dá)88.35％和67.2％。說(shuō)明葡萄籽原花青素為抗自由基的有效活性成分。
（4）在亞油酸體系中，原花青素的抗氧化能力高于VC和VE。相同質(zhì)量濃度時(shí)，二聚體的抗氧化性能*強(qiáng)，OPC’s的抗氧化性隨添加量增加而增加?！?p>參考文獻(xiàn)
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 *基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2001BA507A04-P02）。
  作者簡(jiǎn)介：朱靖蓉（1972～  ），女，新疆烏魯木齊人，實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊钚猿煞帧?div id="dlmd1mn" class="datumrelate">上一篇：NKA-9 HPD-100，AB-8，D-103，HPD-300樹(shù)脂對(duì)水紅木果色素的吸附比較
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